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Beurteilung und Grenzen der "neuen" Referenzmethode mit FDA an Oberflächenmycelien

Drawert (1960) stellt zum Fluorescein in bezug auf die älteren der oben genannten Arbeiten fest: "Von pH 2 bis 5 lassen die Zellen im Hellfeld eine gelbe Kern- und Plasmafärbung erkennen, die von pH 2 bis 3,5 recht intensiv ist, dann aber mit fallender cH [!] an Intensität stark verliert und bei pH 5 nur noch ganz zart in Erscheinung tritt". Später stellt er fest, daß nur lebendes Plasma mit Fluorescein fluorochromierbar ist und totes Plasma den Farbstoff nicht aufnimmt. Der pH-Wert müsse allerdings weiter eingeschränkt werden, denn bei pH 2 - 3,5 würden auch einige tote Epidermiszellen gefärbt, ab pH 4 jedoch nur noch die lebenden (Drawert 1960). Der optimale Bereich liegt danach also zwischen pH 4 und 5.

Die Ergebnisse zur Fluorochromierung nur lebender Pflanzenzellen können für die untersuchten Pilzarten bei pH 5 bestätigt werden. Im Gegensatz zu den oben genannten Untersuchungen, die nicht an Pilzen durchgeführt wurden, ergab sich aber an den Untersuchungsobjekten bei der Färbung mit FDA im Bereich von pH 3 bis pH 5 kein Unterschied: Die stoffwechselaktiven Hyphen fluoreszierten bei beiden pH-Werten gleich stark. Ob dies an den Pilzen oder am FDA liegt, konnte nicht überprüft werden. Ebenfalls identisch waren die Ergebnisse im pH-Bereich von pH 7 und pH 9: Aufgrund der FDA-Fluoreszenz war keine Unterscheidung zwischen lebenden und toten Hyphen möglich.

Söderström (1976) beschreibt eine Methode, die in Abhängigkeit von Zuwuchs und Stoffwechselleistung eine proportionale Färbung mit FDA erzielt. Er verwendet eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 und detektiert per Photometer das entstandene Fluorescein aus FDA. In der Arbeit wurden bodenbewohnende Pilzen untersucht. Vor ihm hatten schon Hercik (1939) und Enöckl (1959) auf einen direkten Zusammenhang zwischen der Fluoreszenzstärke und der Vitalität bei Verwendung von Fluorescein hingewiesen.

Eine solche Proportionalität scheint es auch bei holzzerstörenden Pilzen zu geben. Werden Mycelien älterer Kulturen mit FDA untersucht, muß der Farbstoff länger einwirken (15 Minuten, an drei Kulturen beobachtet), als es bei jüngeren (1-2 Minuten) nötig ist. Nach dieser Zeit fluoreszieren die Mycelien in gleicher Intensität. Ältere Hyphen liegen oft tief und geschützt im Mycelgeflecht, und es dauert eine Zeitlang, bis das FDA dorthin diffundiert ist. Aber auch oberflächlich liegende Mycelien brauchen - in Abhängigkeit vom Alter - unterschiedlich lang, bis sie fluoreszieren. Allerdings ist eine Beobachtung des langsamen Ansteigens der Fluoreszenz nicht möglich, weil das Fluorescein zu schnell ausbleicht (s. u.). Entnimmt man jedoch zwei Proben älteren Materials (z. B. sechs Wochen alte Kultur von S. lacrymans BAM 133) von dicht beieinander liegenden Stellen, versetzt sie mit FDA und untersucht eine Probe nach zwei Minuten, die andere nach 15, so fluoresziert die zweite stärker als die erste.

Ein Problem bei Arbeiten zur Vitalitätsbestimmung beruht auf der von Drawert (1960) und Söderström (1976) bereits bemerkten Ausbleichung des Fluoresceins: Unter starker Belichtung bleicht Fluorescein im Plasma innerhalb von ca. 30 Sekunden aus. Dafür ist besonders das energiereiche Licht im Spektralbereich unterhalb von 480 nm verantwortlich. Das Ausbleichen lebender Zellen (bzw. auch toter Zellen bei entsprechendem pH-Wert über 5) geht jedoch langsamer voran als das einer einfachen Farbstofflösung: Sie sind viel strahlenresistenter. Fluorescein in der freien Lösung bleicht dagegen innerhalb von wenigen Sekunden aus. Da beim Rastern mit dem CLSM immer nur ein kleiner Punkt beleuchtet wird, bleichen Hyphen mit reger Plasmaströmung viel langsamer aus als jene mit geringer Strömung. Bei ersteren fließt stets "frisches" Fluorescein nach. Energieärmeres Licht führt zwar zu wesentlich langsamerem Ausbleichen, jedoch auch zu einer deutlich schwächeren Fluoreszenz. Folglich müssen Messungen der quantitativen Stoffwechselaktivität schnell durchgeführt werden.

Auf einen anderen Zusammenhang, der hier auch aufgefallen ist, wurde auch schon von Drawert (1960) aufmerksam gemacht: Insbesondere lebendes Mycel nimmt viel Fluorescein aus seiner Umgebung auf. Dies kann auch für FDA bestätigt werden. Es ist in dem beschriebenen pH-Bereich ein Unterschied, ob nur totes oder totes und lebendes Material zusammen untersucht wird. Im ersten Fall fluoreszieren die Zellwände der toten Hyphen leicht, im zweiten sind sie nur unter Schwierigkeiten zusammen mit den lebenden darstellbar. Hierzu werden die Detektoren der Grünanregung sehr hoch eingestellt, und das Fluorescein wird etwas ausgebleicht, so daß die Intensität der Fluoreszenz nicht zu groß ist. Nach Drawert (1960) ist dies auf die unterschiedlich starke Aufnahme bzw. Affinität von lebenden und toten Zellen zurückzuführen. Die Färbung der Zellwände und toter Plasmareste ist bei FDA im Vergleich stärker, wenn sich kein lebendes Plasma in der Probe befindet. In den meisten Proben aus Gebäuden finden sich jedoch genügend lebende Hyphen und Sporen von Schimmelpilzen, die stark fluoreszieren. Diese können somit als Eichung der FDA-Lösung dienen. Ohne einen solchen Anhaltspunkt ist es zunächst oft schwer, tote Hyphen sofort richtig anzusprechen, weil dem Betrachter ein Vergleichswert fehlt.

In ganz seltenen Fällen konnte eine rote Fluoreszenz mit FDA-Lösung beobachtet werden, die auf Verunreinigungen der speziellen Objektträger zurückzuführen sein könnte.

In einigen von Drawert (1960) beschriebenen Fällen kam es mit Fluorescein auch zur Fluoreszenz in totem Plasma. Dies ist an einigen alkoholischen Präparaten und an einigen durch Einfrieren abgetöteten Proben von Allium-Arten bemerkt worden. Inwieweit dies auch mit FDA und den bearbeiteten Pilzen vorkommen kann, ist nicht untersucht worden. Alkoholische oder tiefgekühlte Präparate sollten nicht zu Vergleichszwecken herangezogen werden, solange dies nicht überprüft worden ist. Im Verlauf dieser Arbeit konnten nie Hyphen gefunden werden, die fluoreszierten und gleichzeitig ein zusammengezogenes Plasma aufwiesen, wie es für tote Hyphen typisch ist. Fluoreszierende Hyphen zeigten stets ein Plasma, das die gesamte Hyphe ausfüllte, und meist auch eine geordnete "Vakuolenstruktur".

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Autor: T. Huckfeldt

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